L'Istituto Storico della Resistenza in Toscana si costituì il 24 ottobre 1953 su impulso di esponenti dei cinque partiti già facenti parte del Comitato toscano di liberazione nazionale quali Carlo Campolmi, Dino Del Poggetto, Enzo Enriques Agnoletti, Mario Fabiani, Mario Leone, Foscolo Lombardi, Attilio Mariotti, Achille Mazzi, Guido Mazzoni, Giulio Montelatici, Nello Niccoli. Lo statuto dell'Istituto all'art. 2 sancisce la conservazione della memoria storica della Resistenza in una prospettiva ampia, che oltre alla guerra di Liberazione comprende anche l'intero periodo fascista .
Negli anni Sessanta l’Istituto dette impulso alla propria attività consolidando il patrimonio documentario e il respiro delle iniziative culturali, acquisendo una collocazione propria e ampiamente riconosciuta nel mondo cittadino e all’interno della rete nazionale degli Istituti storici della Resistenza. L’alluvione del 1966 interruppe temporaneamente il ritmo di crescita dell’Istituto, danneggiando parte del patrimonio librario e archivistico. Ciò nonostante una consistente parte dei giornali clandestini e del materiale archivistico danneggiato fu recuperato, e la biblioteca e l’emeroteca furono reintegrate ed anche ampliate grazie a doni di associazioni partigiane, case editrici e privati. Nel corso degli anni Settanta, in concomitanza con il passaggio di testimone tra i protagonisti e testimoni della Resistenza e le nuove generazioni, avvenne un consolidamento dell'attività editoriale e di ricerca ai fini di valorizzare i filoni politico-culturali maggiormente documentati dall'archivio dell'ISRT.
Gli studi sugli eccidi e le stragi nazifasciste sul territorio toscano, temi delicati e all’epoca ancora trascurati dalla storiografia, furono sviluppati a partire dalla fine degli anni Ottanta per diventare poi nel decennio successivo tra i principali ambiti di ricerca dell’Istituto. Nell’ultimo decennio del secolo l’Istituto ottenne una nuova sede per l’archivio in Palazzetto Pucci, nell’omonima via, e proseguì la pubblicazione del periodico «In/formazione. Notiziario bibliografico di storia contemporanea italiana», che dal 1982 aveva preso il posto degli «Atti e studi dell’ISRT», pubblicati fin dai primi anni Sessanta. Da allora, si rafforzò anche il rapporto con gli enti locali, soprattutto la Regione Toscana, consolidato dal protocollo d’intesa stipulato con la Regione nel 2005 e rinnovato nel 2014 e dalle iniziative per il Settantesimo anniversario della Liberazione. L'ISRT ha promosso studi, pubblicazioni, mostre, seminari dedicati al fascismo, alla deportazione, alla rilettura dell’antifascismo e della Resistenza, alle vicende sociali e militari della seconda guerra mondiale ma anche alla storia lunga dell’Italia repubblicana. Del pari, anche in seguito al trasferimento e alla riunificazione di tutta la documentazione nella nuova sede di via Carducci, sono stati avviati diversi progetti di aggiornamento e ammodernamento degli strumenti descrittivi del patrimonio archivistico, librario, fotografico e sonoro, ora largamente disponibili in modalità telematica, è stata rilanciata l’attività formativa e di sostegno alla didattica nei diversi ordini di insegnamento, sono state sviluppate le attività di ricerca e l’intervento culturale nella vita cittadina e regionale.

Attualmente l'archivio conserva oltre 120 fondi. Il nucleo originario dell'archivio si costituì alla nascita dell’Istituto grazie all’acquisizione delle carte prodotte dal Comitato toscano di liberazione nazionale, dal Comando volontari della libertà e dai Comitati di liberazione della provincia di Firenze. Questi fondi – conservati grazie alla cura di Carlo Campolmi – furono prelevati da Foscolo Lombardi e da Carlo Francovich, allora direttore dell’ISRT, e depositati nei locali di Palazzo Medici-Riccardi nel corso degli anni Cinquanta, dove nel frattempo giunse anche quanto sopravvissuto dell’archivio della Prima Divisione “Giustizia e Libertà”, versato dal comandante partigiano Luigi Gori. Negli stessi anni l'Istituto si adoperò attivamente per arricchire il patrimonio archivistico, rinnovando in più occasioni «l’invito a chiunque possegga documenti e cimeli che interessino la storia della Resistenza in Toscana […] perché voglia depositarli presso l’Istituto, sottraendoli così al rischio fatale di andar dispersi».
Cominciarono, quindi, a susseguirsi i primi versamenti di carte da parte di privati, in primis personalità dell’antifascismo e della Resistenza fiorentini quali Enzo Enriques Agnoletti, Francesco Berti, Luigi Boniforti, Carlo Campolmi, Carlo Francovich, Mario Augusto Martini, Achille Mazzi, Nello Niccoli e Nello Traquandi. Durante gli anni Sessanta e Settanta si concretizzarono alcuni dei versamenti più rappresentativi. Nel 1961 Ada Cocci, vedova del giurista, intellettuale e costituente Piero Calamandrei, donò  le carte del marito; nello stesso anno fu acquisito il fondo di Aldobrando Medici Tornaquinci, sottosegretario del Ministero dell’Italia occupata nel governo Bonomi e Consultore nazionale. Nel 1969 vennero depositati gli Archivi di Giustizia e Libertà, costituiti oltre che dai documenti dell'organizzazione anche dalle carte di Carlo Rosselli, Alberto Tarchiani, della Mazzini Society e di GL Egitto. Assieme ai fondi minori donati da singoli esponenti dell’area azionista fiorentina, l’ISRT conserva anche le carte prodotte dal Partito d’azione di Firenze e dalla redazione del «Non Mollare», dal Partito socialista unitario, dal movimento di Unità popolare e dalla redazione del suo organo di stampa, «Nuova Repubblica». In seguito, oltre al  riordino delle carte di Foscolo Lombardi, si completò il versamento delle carte di Tristano Codignola e delle carte di Fernando Schiavetti. A metà anni Ottanta furono acquisiti il fondo di Roberto Battaglia e le carte e la biblioteca raccolti da Marcello Coppetti, acquistate dalla Regione Toscana e affidate in comodato all’ISRT. Assieme all’acquisizione delle carte di due  importanti antifascisti espatriati negli Stati Uniti quali Roberto Bolaffio e Michele Cantarella, il versamento più rilevante fu quello delle carte di Gaetano Salvemini; queste ultime comprendono i manoscritti e i materiali di lavoro, nonché la ricca corrispondenza. Tra i fondi pervenuti negli anni Novanta si ricordano il fondo donato dall’Associazione nazionale ex internati - Anei,  le carte di Angiolo Gracci e le carte donate da Orazio Barbieri. Negli anni più recenti l'Istituto ha acquisito a vario titolo, tra gli altri, gli archivi prodotti da Domizio Torrigiani, Manlio Cocchieri e Paolo Barile.
Oltre all'archivio il patrimonio dell'ISRT si compone di una biblioteca di circa 55.000 volumi e opuscoli, di un'emeroteca di oltre 2.000 periodici, circa 2.000 volantini e manifesti, circa 200 testimonianze audio, circa 8.000 scatti fotografici, 400 film e documentari acquisiti sul mercato o ricevuti in dono.